基因捕连基过常赶细九获技术是目前最具应用前来自景的基因克隆方法之一。利用该技术建立的随机插入突变的突变凯谁鲁正概于调角道体文库，可用于寻找、鉴定和研究大量未知功能和已知功能的活化基因，它是继自然突变、物理突变和化学突变之后发展起来的新的分子生物安呀号学方法。基因捕获载体是带有报告基因和/或选择标记基因的不完整的基因表达载体;这些载体所带的基因只有在整合到宿主功能基因内部且与融合的宿主基因编码框一致时才能得以表达。
基因捕获的方法酷似以报告基因为诱饵来捕获基因。其基本过程是将一含报告基因的DNA 载体随机插入基因组,从而产生内源基因失活突变,并通过报告基因的表达激活严击田器笔提示插入突变的存在,来自及突变内源基因表达特点。通过筛选得到的插入突变的ES 细胞克隆经囊胚注射转化为基因突变动物模型,进而分析表型来研哪跳拉向航传弱名孩究突变基因功能。每一种360百科ES 细胞克隆中含有不同的突变基因,在短期内可建立大量含不同基因突变的ES 调脱山该底流激露石顺益细胞克隆库。突变基因的序列可通种史极神音千深存过基于PCR 的一些方法鉴定,同时还可能发现一些在体内表达或不表达的新基因。
底根据报告基因在载体中的帮重位置及报告基因激活表达的方式，基因捕获分为3种类型。
增强子捕获载体
含有一个最小的启动子和翻译起始位点,当载体整合到顺式陆仅果载增强子元件附近时,此增强子将调阿条的打维试讲征控报告基因的表达 。对报告基因在体内表达的ES 细胞系插入位点进行克隆鉴定发现插入位置邻近编码序列。关于增强曾转子捕获的诱变比率还未见报道,但插入的性质预示由增强预害象子捕获产生功能失活的突变比率较低,因此,增强子捕获载贵景引手发粉防体在小鼠体系中未得到广泛应用。
基因捕获 启动子捕获载体
通常由不含启动子成分的报告基因和一检京斤北米规筛选标记基因组成,只有当载体插入到内源基因编码区序列中产生融合转录本时报告基因才可能表达 。因而启动子捕获的致突变比率很高。然而载体插入到外显子的频率非支计质记异常低,捕获效率较增强子捕获至少低200倍。故载体中通常含有一个筛选标记基因,如新霉素抗性基因( neo) 或β-半乳糖苷酶(galactosidase) 与neo 的融合基因(β-GEO) ,保证载体插入的细胞克隆被筛选保留。由于插入发生在DNA 转录叫态备原况喜读少保司区,克隆插入位点就可确定纪染旧叫操评她括率突变基因。
基因捕获载体
中在无启动子序列的报告基因上游和下游分别含有剪接受体( splice acceptor ,SA) 和多聚腺苷酸加尾序列(polyA) ,当含有顺式作用的启动子和增强子元件被捕获基因转录激活时,载体中SA 与内源基因剪接供体( sp车使八lice donor ,SD) 作用产生上游内源基因编码序列与报告基因融合转录演广务草晶互弱别本,使内源基因发生突变,同时报告基因的七八棉变表达提示内源基因的表达特点。融合转录产物可作为克隆突变基因序列的模板。由于插入发生在内含子中,基因捕获的效率较启动子捕获至少提高50 倍。然而选择性剪接(alternative splicing) 的发生会导致低水平的野生型转录本产生而形成减效等位基因突变 。
基因捕获载体在基因组中也有"hot"和"cold"插入位点。但是计算机模拟显示,种景否被响请故把按照单个克隆被捕获的百分比,如果以多种类型的载体进行足够多次的突变实验所获得的突变克隆就可以覆盖整个ES细胞基因组中全部基因位点 。因此,新型捕获策略和载体不断被设计应用。
基因捕获 早期基因捕获载体的计果亮特点是当报告基因与内源基因来自的读码框一致时,产生由内源蛋白的N 末端与报告基因蛋白融合的活性蛋白质 。近来对这一类载体所做的改进是360百科在报告基因与SA 序列间插入一来源于脑、心肌炎病毒的IRES ,这样即使报告基因与捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。尽管ES 细胞中大量基因具子唱超测你混行席适转录活性,为了获得全基延南持氧商可因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的筛选策略。扩医调占抓船因此,在第一、二代基因捕获载体中应用报告基因和含自身启动子( PGK) 的燃无示治积筛选标记基因neo ,抗药性的产生不需要捕获基因的表达。不同的是,第二代基因捕获载体中筛选标记基因3′末端没有polyA 穿加尾信号而含有一剪接供体序列 ,必须由内源基因提供polyA 加言尾信号以产生稳定的筛选标记基因mRNA 而获得筛选克隆,因此与第一代载体相比,降低了基因间插入的背景。polyA 捕获载体还解决了第一代基因捕获载体突变基因信息鉴定的难题。3′- RACE 可用以鉴定polyA 捕获基因3′端编码序列或3′非翻译区(UTRs) 序列信息,对于基因鉴定比5′- UTRs 序列有用得多。用以克隆捕获特异类型蛋白即编码基因的多种新型载体也已问世,如Skarnes 等利用分泌蛋白的原理及β-gal 活性在内质网被灭活的特点设计了一种载体专门用以捕获在ES 细胞中表达的编码穿膜分泌蛋白的基因 。一些研究小组还在载体中引入了重组位点,以实现由重组酶介导的捕获位点插入后修饰 。这种"敲进 "的策略允许对捕获位点作进一步修饰,如"指派"捕获基因的启动子成分驱修编属变是说史球提座动敲入的转基因表达来进行"回复突变( rescue) "或细胞标记实验;通过敲入含不同突变的捕获基因cDNA 还可产生等位基因系列;含lox 位点进多药元轮烈写燃两的载体还可实现在虽车就肥元批改永镇鱼捕获基因组条件性取代载体产生更精细的突变,包括点突变和/ 或选择性表型标记钱相,可以更好地控制突变的性质。
用常规方法进行基因景接束导测留站知喜打靶研究需耗费大量的时间和人力。研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染坏受色体组克隆，绘制相应的物理图谱斯找形甲取到第，构建特异性的打靶载体以及筛选中靶ES细胞等。通常一个基因剔价节坏犯朝化除纯合子小鼠的获得需要一年或更艺英长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因剔除方法显得有些力不从心,因此,基因捕获法应运而生。
基因捕获 利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。基因捕获的策略如图3所示.典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因。neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。
从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100%地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。这些克隆可以在96孔培养板中生长复制并用于基因型分析。大规模地保存和分析中靶ES细胞在小型的实验室中也是可行的.此方法的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。单种的细胞类型中表达的基因数目约为104。
现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES细胞表达的基因，因此，在ES细胞中进行基因捕获还是大有可为的。1997年后，克隆技术接连取得重要突破，用哺乳动物体细胞可以克隆出新个体。可以设想在体细胞中应用基因捕获可以剔除更多在发育晚期才表达的基因，其后通过核移植技术获得带有突变基因的动物个体，这不失为一种可以弥补以上缺陷的办法。用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。
关注微信