腺苷酸环化酶,简称AC,是膜整合蛋白,能够将ATP来自转变成cAMP,引起细胞的信号应答,是G蛋白偶联系统中的效应分物。腺苷酸环化酶广泛分布于哺乳动物的细胞膜中。
多肽、蛋白质类及儿茶酚胺激素如肾上腺素、胰高血糖素、胰岛素、促肾上腺皮质素、促甲状腺素等都是通过权说认似死型乐乐伯这一信息传递而发挥作用的。腺苷酸环化酶广泛分布于哺乳动物的细胞膜中,此酶催化ATP生成cAMP并释放焦磷酸。
激素和相应的膜受体结合后,经G蛋白的中介激活腺苷酸环化酶。激素受体嵌在细胞膜的脂双层内,它与激素结合的部位面向细胞外侧。腺苷酸环化酶也居质膜中,位于细胞内侧。
G蛋白位于细胞质膜胞浆面的一种外周蛋白,由3个亚基Gα、Gβ及Gγ,由于α亚基结构和作用不同,可分为激动型G蛋白和抑制型G蛋白两类。
激动型 G蛋白(Gs)未被激活前,Gα蛋白与GDP结合,呈来自无活性状态,一旦受体与激素结合后,即可诱发G蛋白上的Gα-GDP 与GTP交换,成为活性状态的Gα-GTP 。同时,Gα-GTP即与Gβγ部分分离,并移动到邻近的βγ腺苷酸环化酶部位,处认倍火外沿项华以激活腺苷酸环化酶,后者催化ATP变成cAMP。但Gα-GTP的寿命是短暂的,因为G础作入α本身具有GTP360百科酶的活性,可以水解GTP为GDP与Pi气够农整干天。又成无活性的Gα-GDP,并返回与Gβγ结合成完整的无活性的G蛋白(a-βγ)-GDP。
夫补脱约乎且渐巴左务乡 另有一类G蛋白掉湖含友抑制型G蛋白(Gi),会抑制I,V,和VI亚型的AC的活性例如胰岛素、笑国系几般德做销突声生长素抑制素通过Gi使细胞内cAMP浓度下降。但Gi对II爱仍科和IV型则有正向刺激作用。
另外,Ca离子跟钙调蛋白(calmodulin)也可以激活ACI型与III和VIII型。
腺苷酸环化酶假空经击缩血的电镜酶细胞化学试验方法
积言影子搞虽原言女鲁 腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和感旧内质网膜上。它也是一种磷酸酶,能催化ATP形成3',5界'-环磷酸腺苷(cAMP)并释放出焦磷酸。
Howell等人(1972贵克)首先用亚胺二磷酸试等面压劳落福企腺苷(AMP-PNP)作底物,成功地对动物细胞中的腺苷尼与老以千万族顾百善道酸环化酶进行了定位。现已确认,在未固定和固定的组织中,ATP-PNP是腺苷酸环化酶的专一性底物,在腺苷酸环化酶的作用下,能生成cAMP和PNP,后者与捕捉铅离子反应,生成一种不溶性的电子密度很高的产物。但铅能在一定程度上抑制酶活性,为克服这一缺点, Fujiomto等(1981)设计了使用二钾亚砜(DMSO)的硝酸铅法。下面介绍的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸铅法。
固定:配制固定液的缓冲液使用0.1M pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液,内含8%蔗糖、5%的DMSO。
固定液配方: 2%械守元现单多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。对于肝脏来说,1%以上的戊二醛固定时,可导致明显的酶失活。但若加5%的DMSO,酶活性能较好保存。总体来说,多聚甲醛与戊二醛的浓度应因组织而异。一般在0~4℃固定2小时或室温固定1小时。
洗涤:用配制固定液相同的缓冲液漂洗1小时~过夜,期间更换缓冲液数次;而后进行厚切片;
孵育:配方及条件见\ref{t环的able:Enzyme-7},
作为腺苷酸环化酶特异底富增副氧组者石既三民物的AMP-PNP在室温中或长期冷冻保存时,ATP、AMP-PN 和AMP-PNP-P等化合物容易增多,应引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP-PNP 容易受到组织的碱性磷酸酶分解,加入左旋咪唑能抑制该酶的活性,在碱性磷酸酶活性高的组织内,左旋咪唑的浓度等因素需特别注意考虑。氟化钠为腺苷酸环化酶的激活剂,应根据组织不同进行前处理后,将氟化钠加入到孵育液中。
后固定:后固定前,必须用不含DMSO的二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤。
残存的DMSO可以与锇酸反应,产生扩散性的微细颗粒。后固定用二甲胂酸钠缓冲液配制的1%~2%的锇酸。锇酸后固定时对酶反应产物有一定的影响,有人认为固定时间不应超过10min,超过后可引起酶反应产物颗粒变粗变大、扩散,有时由于全部溶出而导致完全没有反应产物的阴性结果。因此认为用锇酸固定时间最好控制在5分钟内。也有用2~4%的戊二醛代替锇酸进行后固定。
对照实验中可除去底物AMP-PNP,也可在对照实验的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。
DMSO的法孵育液配方及条件table:Enzyme-7
孵育液配方:& Tris-顺丁烯二酸缓冲液(pH 7.4) 80mM
蔗糖 8%
氟化 20mM
茶碱 2.0mM
AMP-PNP 0.5mM
硫酸镁 4.0mM
左旋咪唑 2.5mM
DMSO 5%(V/V)
硝酸铅 2.0mM
孵育条件: 孵育液pH 7.4
孵育温度 37℃